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無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展、優(yōu)化和應(yīng)用

更新時(shí)間:2022-06-24      點(diǎn)擊次數(shù):5117
      1.無(wú)血清培養(yǎng)基發(fā)展歷程
  隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷擴(kuò)大和提高,無(wú)血清培養(yǎng)基的研制和開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展已有60多年的歷史,其中經(jīng)典培養(yǎng)基(ClassicalMedia,CM)主要是指20世紀(jì)五六十年代一些公開(kāi)配方的傳統(tǒng)培養(yǎng)基,如MEM、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12等,此類培養(yǎng)基需要配合10%左右的牛血清才能使用。由于牛血清成分復(fù)雜、批次間差異較大,培養(yǎng)過(guò)程中有外源物污染的風(fēng)險(xiǎn),因此科學(xué)家們一直致力于研究牛血清替代物,研發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基。
  無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷經(jīng)了無(wú)血清來(lái)源、無(wú)動(dòng)物源、無(wú)蛋白和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等4個(gè)階段,逐步使得無(wú)血清培養(yǎng)基的成分更為明確和簡(jiǎn)單,進(jìn)一步提升了無(wú)血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中可避免外源物污染等優(yōu)勢(shì),使其在生物制品和生命科學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。
  1.1無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum-FreeMedium,SFM)
  無(wú)血清培養(yǎng)基,即不添加動(dòng)物血清。為滿足細(xì)胞的生長(zhǎng),此類培養(yǎng)基會(huì)添加替代血清功能的成分,如大量動(dòng)植物來(lái)源的蛋白,這使得添加物質(zhì)的化學(xué)成分不夠明確,會(huì)對(duì)后續(xù)處理造成不利影響。
  1.2無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基(AnimalComponentFreeMedium,ACFM)
  為滿足細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的需要,此類培養(yǎng)基采用蛋白水解物、重組蛋白或其他化學(xué)物質(zhì)替代動(dòng)物源蛋白,以避免動(dòng)物來(lái)源的風(fēng)險(xiǎn),降低生產(chǎn)成本,但該類培養(yǎng)基的產(chǎn)量較低。
  1.3無(wú)蛋白培養(yǎng)基(Protein-FreeMedium,PFM)
  無(wú)蛋白培養(yǎng)基是指*不含有血清和動(dòng)物源的蛋白,但仍包括來(lái)源于植物蛋白的水解物,如大豆水解物或含有合成多肽等其他衍生物。該類培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量極低,水解物不穩(wěn)定,雖然化學(xué)成分明確,有利于重組蛋白的下游分離和純化,但通用性較差,需要針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞株進(jìn)行特異性的優(yōu)化。
  1.4
  化學(xué)成分限定培養(yǎng)基(ChemicallyDefinedMedium,CDM)
  化學(xué)成分限定培養(yǎng)基是指*無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物蛋白,也不含植物水解物,是一類化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基批次間差異小,提高了生產(chǎn)工藝的重復(fù)性,并有效降低了純化成本。因?yàn)榛瘜W(xué)成分明確,有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝及調(diào)控研究,是工業(yè)生產(chǎn)抗體和重組蛋白的主流培養(yǎng)基,也是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。
  2.無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)化
  2.1
  優(yōu)化策略
  通常,為了更好地優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基的組分,研究人員采用培養(yǎng)過(guò)程分析法、分子生物技術(shù)法和統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)法。培養(yǎng)過(guò)程分析法是指通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝副產(chǎn)物的濃度變化,研究細(xì)胞的代謝活動(dòng);分子生物技術(shù)法可在分子水平上觀察細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的變化,有助于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝狀態(tài);統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具優(yōu)化培養(yǎng)基,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,盡可能減少試驗(yàn)次數(shù)分析多種因素。
  2.2
  培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)和優(yōu)化中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DesignofExperiment,DOE)
  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)是一種計(jì)劃實(shí)驗(yàn)和分析所獲得信息的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法,它的優(yōu)勢(shì)在于一次評(píng)估多個(gè)組分及其相互作用,減少不必要的實(shí)驗(yàn)規(guī)模和數(shù)量,并允許觀察培養(yǎng)基組分之間復(fù)雜的相互作用。
  在細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3個(gè)步驟。
  ①篩選,基于現(xiàn)有商業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,以確定重要組分的群組以及初步優(yōu)化,如使用簡(jiǎn)單的、以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)的單次單因子(OneFactorataTimeStrategy,OFAT)方法解決復(fù)雜的優(yōu)化。
  ②優(yōu)化,基于DOE對(duì)已確定的重要組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,主要優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基、一些添加物等,如使用響應(yīng)曲面法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)找出多變量體系中的*優(yōu)條件。
  ③驗(yàn)證,對(duì)最終的培養(yǎng)基進(jìn)行放大驗(yàn)證,分別用優(yōu)化好的培養(yǎng)基與現(xiàn)用的或商業(yè)無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,比較各自的生長(zhǎng)指標(biāo)與抗體表達(dá)水平。
  培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)的基本方法
  篩選階段也可基于Plackett-Burman設(shè)計(jì),從大量因素中篩選出若干個(gè)的影響因子。優(yōu)化階段使用響應(yīng)面分析法,常用方法有(圖1a)CentralComposite和(圖1b)Box-Behnken等來(lái)確定重要影響因子。
  3無(wú)血清培養(yǎng)基的應(yīng)用
  大部分生物制藥是利用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥生產(chǎn)工藝的核心技術(shù),而細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ),是生物制藥生產(chǎn)的關(guān)鍵原材料之一。目前細(xì)胞培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于重組蛋白、單克隆抗體、疫苗和基因治療藥物的表達(dá)載體等生物制品的生產(chǎn)。
  3.1在單抗和重組蛋白細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的應(yīng)用
  目前CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)已經(jīng)成為需要復(fù)雜翻譯后修飾的治療性蛋白及單抗藥物生產(chǎn)的宿主細(xì)胞,70%以上的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)藥物產(chǎn)品都是以CHO細(xì)胞表達(dá)的。在單抗藥物中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基基本上是化學(xué)成分限定培養(yǎng)基(ChemicallyDefinedMedium)和補(bǔ)料(Feed)。例如,HyCloneActiPro和補(bǔ)料7a/7b是針對(duì)表達(dá)重組蛋白和抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基,它是根據(jù)細(xì)胞代謝途徑分析方法設(shè)計(jì)的化學(xué)成分限定,不含動(dòng)物源成分的商業(yè)化培養(yǎng)基。使用ActiPro培養(yǎng)基適當(dāng)搭配CellBoost7a/7b補(bǔ)料培養(yǎng)基可明顯提高產(chǎn)量,ActiPro系列適用于多種CHO細(xì)胞系列,如CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S。
  3.2在病毒疫苗細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的應(yīng)用
  自2020年以來(lái),病毒肺炎在世界范圍內(nèi)爆發(fā)和流行,嚴(yán)重威脅了人類的生命健康,而病毒疫苗的研發(fā)和使用是應(yīng)對(duì)病毒傳播和流行的重要手段。傳統(tǒng)疫苗領(lǐng)域使用經(jīng)典培養(yǎng)基添加牛血清生產(chǎn)疫苗,血清成分復(fù)雜性和外源污染帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn),而無(wú)血清培養(yǎng)基可以解決病毒疫苗中的血清問(wèn)題。在病毒疫苗規(guī)模化培養(yǎng)中,無(wú)血清培養(yǎng)的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)符合細(xì)胞貼壁特性和高細(xì)胞密度的無(wú)血清培養(yǎng)基。疫苗生產(chǎn)使用的無(wú)血清培養(yǎng)基HyCloneVaccineXpress適用于貼壁細(xì)胞依賴性細(xì)胞系(Vero細(xì)胞)的高密度生長(zhǎng)和維持,目前已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn),如流感(Influenza)、寨卡(Zika)、脊灰(Polio)、登革熱(Dengue)和呼吸道合胞體病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)等多種病毒類疫苗。
  3.3在細(xì)胞/基因治療所用病毒載體的生產(chǎn)平臺(tái)的應(yīng)用
  人胚腎細(xì)胞系HEK293廣泛用于治療生物制品的生產(chǎn),如用于基因治療的病毒載體、溶瘤細(xì)胞藥物、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗等,通常采用化學(xué)限定的的無(wú)血清培養(yǎng)基。
  3.4在細(xì)胞療法中的應(yīng)用
  干細(xì)胞(StemCells,SC)是一類具有自我修復(fù)能力的多潛能細(xì)胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞治療傾向于采用無(wú)血清培養(yǎng)基,也有一些用于研究的干細(xì)胞培養(yǎng)采用加血清的α-MEM*培養(yǎng)基。在腫瘤治療方面,基于樹突狀細(xì)胞(DendriticCells,DC)的腫瘤疫苗被認(rèn)為是治療惡性腫瘤的一種有效途徑。使用無(wú)血清培養(yǎng)可以*解決DC腫瘤疫苗治療中血清干擾的問(wèn)題。在免疫細(xì)胞治療方面,CAR-T、CAR-NK通常也采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
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